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        胰酶使用的注意事項

        2022-10-10 瀏覽次數(shù):1410

        胰酶使用注意:

        1、在使用胰酶細(xì)胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細(xì)菌污染。

        2、胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞時間不宜過長,否則細(xì)胞鋪板后生長狀況會較差。

        貼壁細(xì)胞的消化:

        1、吸去培養(yǎng)液,用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次,以去除殘余的血清

        2、加入少量胰酶細(xì)胞消化液,略蓋過細(xì)胞即可,根據(jù)胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鐘(不同的細(xì)胞消化時間有所不同)

        3、顯微鏡下觀察,細(xì)胞明顯收縮,并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化呈白茫狀;或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來。

        4、此時吸除胰酶細(xì)胞消化液。加入含血清的*細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打下細(xì)胞,即可直接用于后續(xù)實驗如果發(fā)現(xiàn)消化不足,則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。

        如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時間過長,未及吹打細(xì)胞,細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落,直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘,沉淀細(xì)胞,盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后,加入含血清的*培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞,即可用于后續(xù)實驗。

        常用的細(xì)胞消化液為胰蛋白酶(Trypsin),EDTA等,其功能主要是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)(如細(xì)胞外基質(zhì))水解,改變細(xì)胞間的連接,使組織或細(xì)胞片分散成單個細(xì)胞,制成細(xì)胞懸液用于進(jìn)一步的實驗。

        影響消化速度的因素較多,主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時間長短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時間及溫度等)、消化時的溫度(氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等 。

        加入胰蛋白酶-EDTA溶液,視細(xì)胞瓶的大小加入體積為2ml或更多(依培養(yǎng)器皿的大小而定),以使充分浸潤;

        一般消化時間約為1至3分鐘,肉眼觀察瓶底由半透明(細(xì)胞單層連接成片)轉(zhuǎn)為透明、點狀(出現(xiàn)細(xì)小空隙)時,棄去細(xì)胞消化液,或看見培養(yǎng)瓶壁呈白茫狀即可。并加入適量的*培養(yǎng)液終止消化,吹打分散;如見大量細(xì)胞片狀脫落,已消化過頭,則不能頃倒消化液而直接進(jìn)行下一步操作。(消化過頭,可造成大量細(xì)胞從瓶壁上脫下,甚至造成細(xì)胞破碎。由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑,所以加入*培養(yǎng)基可以終止反應(yīng)。

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