從北京到世界: CHO細胞的“中國往事”

 2018-03-26  細胞摩天輪  上海蒂科生物科技有限公司   

*，中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是生產(chǎn)蛋白類藥物的宿主細胞，因為與其他系統(tǒng)相比，CHO細胞具有以下優(yōu)點：①CHO 細胞對蛋白有準確的加工、修飾功能，因此其表達的蛋白質的生物學活性更接近于天然蛋白；②CHO細胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強，可根據(jù)培養(yǎng)要求選擇可貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的方式；③整合外源基因后的細胞穩(wěn)定，重組基因能擴增和表達；④表達的目的蛋白可由細胞內運輸?shù)郊毎猓⑶褻HO細胞只表達少量的內源蛋白，有利于目的蛋白的提取。如今，市場上一半以上zui為的生物制劑是由CHO細胞產(chǎn)生的。如，阿達木單抗（Humira）、貝伐單抗（Avastin）和利妥昔單抗（Rituxan）。可以說，CHO細胞對現(xiàn)代生物藥工業(yè)發(fā)展做出了不可磨滅的貢獻。不過你是否知道CHO細胞zui早的歷史？今天，讓我們簡單梳理一下CHO細胞的前世今生，了解一下CHO細胞背后的故事，或許可以給我們未來的工作更多啟發(fā)和思考。

中國倉鼠（學名 Cricetulus griseus）屬于來自于中國北部和蒙古地區(qū)的嚙齒動物家族。1919年，北京協(xié)和醫(yī)學院的胡正祥教授（注：胡正祥，1896年生，病理學家。1921年畢業(yè)于美國哈佛醫(yī)學院，后在美國麻省總醫(yī)院繼續(xù)學習病理學5年。回國后歷任北京協(xié)和醫(yī)學院副院長，病理系教授、系主任等職，在病理學研究中頗有建樹。）zui早在北京使用中國地倉鼠研究肺炎球菌，由于條件所限，試驗小白鼠很難獲得，正好北京周圍的中國地倉鼠眾多，中國地倉鼠便成為了很好的試驗研究工具。后來在北京協(xié)和醫(yī)學院工作的美國科學家Jocelyn Smyly和Charles Young發(fā)現(xiàn)中國地倉鼠很容易感染寄生蟲利什曼原蟲從而引發(fā)Black fever黑熱病，之后中國的醫(yī)學科研人員都使用中國地倉鼠來研究各種傳染性疾病，中國倉鼠成為了流行病學研究的有力工具。

1948年12月，南京解放前的一個黑暗的深夜，美國洛克菲勒基金會醫(yī)療部（Rockefeller Foundation’s International Health Division）醫(yī)生Dr. Robert Briggs Watson冒著生命危險，帶著一箱20個北京胡正祥教授贈與的、用來繼續(xù)研究在亞洲肆虐的瘧疾的中國地倉鼠，躲過交戰(zhàn)區(qū)，驅車到上海機場。盡管寒冷的雨滴強烈拍打著玻璃，泥石流隨時可以阻斷道路，zui終Watson還是成功地登上了Pan Am航班離開了中國，將這批中國地倉鼠運給紐約的試驗動物專家Victor Schwentker。誰也沒有想到，很多年后，伴隨他的20只中國地倉鼠，會成為當代藥物生產(chǎn)工業(yè)的關鍵“鑰匙”。 

美國科學家后來完成了中國地倉鼠的繁育，使其成為科學研究的有力工具。University of Colorado Medical Center的Dr.Theodore T. Puck和他的下屬同事Fa-Ten Kao在1957年從波士頓癌癥研究中心的Georege Yerganian博士的實驗室獲得了一個雌性中國地倉鼠，并成功分離了CHO細胞株，由于該細胞快速懸浮生長和高蛋白表達的特性，CHO細胞開始在科研和企業(yè)獲得普遍的應用。 

1984年，Genentech公司實現(xiàn)重組中國倉鼠卵巢細胞表達組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)并于1987年成功獲批上市，標志著哺乳動物細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白藥物的一個標志性事件。隨后，許多外源蛋白基因相繼被轉染到哺乳動物細胞，一些有價值的蛋白不斷實現(xiàn)表達，包括凝血因子、促紅細胞生成素(EPO)、免疫球蛋白、尿激酶、乙肝表面抗原（HBsAg）和單克隆抗體等，極大地促進了生物藥工業(yè)的發(fā)展。同時，隨著CHO細胞在實驗室的普及，科學家成功分離出的不同亞型的CHO細胞株，比如CHO-S, , CHO DXB11, CHO DG44， CHO-M以及近年來受到持續(xù)關注的GS基因敲除的CHO細胞（如Merck/Sigma Aldrich公司的CHOZN, Lonza的CHO GS Xceed, Horizon公司用rAAV技術敲除的CHO細胞）。

不過遺憾的是，由于當時特殊的歷史背景，Robert Watson后來被中國細菌戰(zhàn)委員會指控為戰(zhàn)爭罪犯，這也間接導致了協(xié)和醫(yī)學院胡正祥教授的入獄，胡教授后來被作為“反動學術”遭批斗po hai，1966年，胡正祥夫婦先后在家中zi sha。如今在和平年代，撫今追昔，我們緬懷為人類健康事業(yè)做出巨大貢獻的老一輩科學家們，也更加珍惜來之不易的一切。

另一方面，伴隨著CHO細胞應用的普及，CHO細胞培養(yǎng)基產(chǎn)業(yè)也得到了充分的研究和快速的發(fā)展。傳統(tǒng)上CHO細胞的培養(yǎng)是在DMEM/F12基礎培養(yǎng)基中添加5-10%的胎牛血清完成的，血清除了供給細胞的營養(yǎng)成分外，還提供了題為培養(yǎng)細胞增殖所必須的生長因子，但血清的使用存在批次間差異大，易被支原體和病毒等污染，成本高，不利用產(chǎn)品分離純化等很多弊端，以及影響細胞的生長及zui終產(chǎn)物的質量，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。所以從70年開始科學家就開始研究和開發(fā)工業(yè)無血清培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基的開發(fā)大大提高了CHO細胞培養(yǎng)工藝的便利性，可重復性以及降低了產(chǎn)品純化壓力。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，動物細胞無血清培養(yǎng)基經(jīng)歷了動物蛋白水解物培養(yǎng)基，植物蛋白水解物培養(yǎng)基到無血清化學成分限定的培養(yǎng)基等幾個階段。典型的無血清培養(yǎng)基含有50-70中成分，包括氨基酸，維生素，微量元素，生長因子，無機鹽，緩沖體系等。向培養(yǎng)基中添加動物或植物的蛋白水解物可以有效地提高細胞生長密度，延長細胞活性，從而提高抗體表達量，常見的有大豆、酵母和小麥蛋白水解物等，但是由于其成分的復雜性和批次間的質量差異，添加蛋白水解物可能會造成培養(yǎng)基批次間不穩(wěn)定從而影響培養(yǎng)過程和產(chǎn)品質量。所以，目前及未來無血清培養(yǎng)基的趨勢是采用無動物源、化學成分確定的配方進行生物制藥生產(chǎn)。

由于在研發(fā)實力、質量體系、生產(chǎn)控制和品牌影響力等方面的優(yōu)勢，外企培養(yǎng)基公司占據(jù)了細胞培養(yǎng)基市場的絕大部分份額，目前國外的CHO細胞培養(yǎng)基公司有HAKATA（Now part of Therm Fisher）, SAFC(Now part of Merck),  Hyclone(Now part of GE Healthcare), Irvine Scientific（A member of JXTG Group）,  Lonza等，支撐了上市的眾多生物藥的商業(yè)化生產(chǎn)。同時，不同供應商也在努力提高培養(yǎng)基研發(fā)和生產(chǎn)的技術能力，基于不同的細胞培養(yǎng)應用，不斷更新升級換代培養(yǎng)基的配方和配置方法。比如Thermo Fisher/HAKATA通過的AGT技術，使干粉培養(yǎng)基的配置過程變得便捷、簡單。Merck/SAFC去年宣布上市了*個商業(yè)化的用于灌注工藝培養(yǎng)的培養(yǎng)基，來應對灌注培養(yǎng)工藝的挑戰(zhàn)，美國Irvine Scientific公司也新推出了用于GMP-ready 的CHO細胞灌注培養(yǎng)基及用于Fed-batch培養(yǎng)的濃縮的補料BalanCD CHO Feed 4，并且Feed 4干粉配置過程同樣簡單，加水溶解，無需調節(jié)pH，便捷的配置方案對生物藥工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)具有很大的吸引力。

生物醫(yī)藥行業(yè)是中國戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)，國內生物制藥行業(yè)經(jīng)過多年的發(fā)展，目前也有一批本土公司專注于開發(fā)無血清培養(yǎng)基和優(yōu)化細胞培養(yǎng)工藝，也取得了可喜的進展。由于不同細胞株的代謝需求不*一樣，所以很難開發(fā)出一款能夠滿足所有細胞應用需求的“通用型”CHO細胞培養(yǎng)基，同時為了大規(guī)模生產(chǎn)階段成本和工藝和風險控制的考慮，很多公司還是會選擇在項目進展到一定程度后開發(fā)個性化定制培養(yǎng)基，未來培養(yǎng)基的大規(guī)模生產(chǎn)技術 – 能否保證大規(guī)模培養(yǎng)基干粉的質量和批次穩(wěn)定性，也將成為培養(yǎng)基公司的核心競爭力之一。 

總之，CHO細胞的出現(xiàn)給整個生物制藥產(chǎn)業(yè)注入了無窮的活力，產(chǎn)生了巨大的科研和經(jīng)濟價值，并將一直造福人類，同時，使用CHO細胞平臺表達生物藥還面臨這一些挑戰(zhàn)，需要學術和工業(yè)界一起努力，從綜合利用科學和工程的知識來解決，比如

①構建的重組CHO細胞生產(chǎn)效率低，產(chǎn)物濃度亦低，培養(yǎng)工藝復雜，而且CHO細胞株的穩(wěn)定性還較差；

②某些糖基化表達產(chǎn)物不穩(wěn)定，不易純化； 

③重組CHO細胞上游構建與下游分離純化脫節(jié)，主要表現(xiàn)在上游構建時著重考慮它的表達，而對高表達的產(chǎn)物的分離純化過程考慮較少； 

④重組細胞培養(yǎng)費用昂貴，自動化水平低下。 

隨著技術的發(fā)展和我國對生物藥產(chǎn)業(yè)投資支持力度的加大，我們也衷心希望，有朝一日我們能誕生真正屬于我們自己知識產(chǎn)權的“CHO細胞”及相關創(chuàng)新產(chǎn)品，更好地迎接我們生物制藥產(chǎn)業(yè)的新時代。