細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗中常見問題

一、轉(zhuǎn)染效率低

影響轉(zhuǎn)染效率因素很多，主要因素有細(xì)胞培養(yǎng)物、血清、載體構(gòu)建、DNA質(zhì)量以及轉(zhuǎn)染技術(shù)等。

1.沒有使用優(yōu)化條件：優(yōu)化陽離子脂質(zhì)體試劑和DNA的量。

2.DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑復(fù)合物在存在血清條件下形成。

3.存在抑制劑：不要在用于制備DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基中使用抗生素，EDTA，檸檬酸鹽，磷酸鹽，RPMI，硫酸軟骨素。透明質(zhì)酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

4.不恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度：轉(zhuǎn)染時融合度應(yīng)為70%-90%。

5.陽離子脂質(zhì)體試劑凍結(jié)：不要使用凍結(jié)的或儲存溫度低于4℃的陽離子脂質(zhì)體試劑。

6.質(zhì)粒純化的問題。

二、細(xì)胞死亡率高

1.DNA量太高

2.陽離子脂質(zhì)體試劑量太高

3.在轉(zhuǎn)染過程中使用抗菌素：在轉(zhuǎn)染過程中不要使用氯霉素，青霉素或鏈霉素，因為陽離子脂質(zhì)體試劑使細(xì)胞更敏感。

4.細(xì)胞太少

5.在無血清條件下細(xì)胞活性降低：使用OPTI-MEM培養(yǎng)基。確保在不存在血清的條件下形成復(fù)合物。

6.陽離子脂質(zhì)體試劑被氧化：不要過分?jǐn)噭踊蛘袷庩栯x子脂質(zhì)體試劑，這可能會形成陽離子脂質(zhì)體試劑的過氧化物。

7.對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，篩選抗生素加入的太快：在加入篩選性抗生素前至少預(yù)留24-48h使細(xì)胞表達(dá)抗性基因。   

細(xì)胞轉(zhuǎn)染注意事項

1.如為貼壁生長細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必須應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，轉(zhuǎn)染當(dāng)日的細(xì)胞密度以70-90%（貼壁細(xì)胞）或2×106-4×106細(xì)胞/ml（懸浮細(xì)胞）為宜，最好在轉(zhuǎn)染前4h換一次新鮮培養(yǎng)液。

2.用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì)，無RNA和其他化學(xué)物質(zhì)的污染，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。

3.有血清時的轉(zhuǎn)染：

1）在開始準(zhǔn)備DNA和陽離子脂質(zhì)體試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基，因為血清會影響復(fù)合物的形成。其實，只要在DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時不含血清，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。

2）陽離子脂質(zhì)體和DNA的最佳量在使用血清時會有所不同，因此在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清時需要對條件進行優(yōu)化。

3）大部分細(xì)胞可以在無血清培養(yǎng)基中幾個小時內(nèi)保持健康。對于對血清缺乏比較敏感的細(xì)胞，可以使用OPTI-MEM培養(yǎng)基，一種營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基。

4.培養(yǎng)基中的抗生素

抗生素是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使抗生素可以進入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素。

對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些抗生素是GENETICIN選擇性抗生素（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染常用的抗性篩選試劑）的競爭性抑制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。

5.設(shè)置陽性對照和陰性對照。

6.一般在轉(zhuǎn)染24-48h，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實驗?zāi)康模?4-48h后即可進行靶基因表達(dá)的檢測實驗。

7.如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，則可對靶細(xì)胞進行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，常用的真核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素和新霉素等。