ELISA競爭檢測法原理介紹

競爭法一般分為直接競爭法和間接競爭法，這里我們以直接競爭法為例進(jìn)行原理講解。直接競爭法，其基本原理是：將合適濃度的包被抗體包被于微孔板中，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點，加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和生物素標(biāo)記的抗原物質(zhì)進(jìn)行競爭結(jié)合，經(jīng)合適的溫度和一定時間的孵育，洗滌后，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行反應(yīng)，TMB顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈負(fù)相關(guān)。

該方法一般用來檢測具有較少表位的小分子物質(zhì)，當(dāng)然，這種方法也可以用來檢測大分子抗原物質(zhì)甚至是抗體。檢測大分子抗原物質(zhì)時，由于空間位阻的影響，使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質(zhì)靈敏度高。這種方法在檢測抗體時，可能由于兩種競爭的抗體來源不一，導(dǎo)致兩種抗體趨同性不高，就使得檢測結(jié)果的可靠性不高。

當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測一般采用此法。

實驗步驟

以稀釋液將待檢標(biāo)本做適當(dāng)稀釋（預(yù)試中確定）加入包被有已知抗原的酶標(biāo)板中（50ul/孔），加封口膠帶于37℃作用30min。

2.  棄反應(yīng)液，以沖洗液連續(xù)洗板5次并于吸水紙上拍干。

3.  加入酶標(biāo)抗體（濃度在預(yù)試中確定）。加封口膠帶后于37℃作用30min。

4.  重復(fù)第2步。

5.  加底物（濃度在預(yù)試中確定），加封口膠帶后于室溫下避光作用5-60 min，其間不時觀察，顯色滿意后加終止液50ul/孔。

6.  于酶標(biāo)儀測定OD值，OPD用492nm測定，TMB用450nm測定。

注意事項

每次實驗均應(yīng)做陰性對照、陽性對照及空白對照（以PBS代替標(biāo)本），后者為本底值，在分析實驗結(jié)果時應(yīng)扣除本底值，陽性對照<陰性對照<空白對照實驗成立。

2.  一般認(rèn)為小分子抗原宜用本法檢測，而大分子抗原則宜采用夾心法檢測，但具體宜采用哪種方法應(yīng)根據(jù)試驗決定，本發(fā)與夾心法相比在操作上減少一步。包被抗體與酶標(biāo)抗體如果分別采用單克隆抗體和多克隆抗體時，宜用單克隆抗體作為包被抗體，以多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體。

3.  血清標(biāo)本中抗原濃度一般較低，故一般用原倍標(biāo)本進(jìn)行檢測，必要時可進(jìn)行稀釋測定，但應(yīng)重新摸索酶標(biāo)抗原的濃度，以確保方法的靈敏性。

4.  以酶標(biāo)記抗原的方法同酶標(biāo)記抗體。

5.  其它注意事項同酶聯(lián)免疫間接法。