基因重組—層析法
實(shí)驗(yàn)方法原理
攜帶有目標(biāo)蛋白基因的質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中，在 37℃，IPTG誘導(dǎo)下，超量表達(dá)攜帶有6個(gè)連續(xù)組氨酸殘基的重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白，該蛋白可用一種通過(guò)共價(jià)偶連的次氨基三乙酸（NTA）使鎳離子（Ni2+）固相化的層析介質(zhì)加以提純，實(shí)為金屬熬合親和層析（MCAC）。蛋白質(zhì)的純化程度可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。

實(shí)驗(yàn)材料
大腸桿菌BL21
試劑、試劑盒
LB液體培養(yǎng)基 氨芐青霉素 Washing Buffer Elution Buffer IPTG 蒸餾水 胰蛋白胨 酵母粉 氯化鈉
儀器、耗材
搖床 離心機(jī) 層析柱 離心管 移液槍 槍頭盒 燒杯 玻璃棒

實(shí)驗(yàn)步驟
一、試劑準(zhǔn)備
1.  LB液體培養(yǎng)基：Trytone 10 g， yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸餾水配至1000 mL。
2.  氨芐青霉素：100 mg/mL。
3.  上樣緩沖液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM  2-ME，pH8.0。
4.  Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。
5.   Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea， 500 mM Imidazole， pH8.0。
6.   IPTG：100mM IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22 um濾膜抽濾，-20℃保存。

二、獲得目的基因
1.  通過(guò)PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn)），PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
2.  通過(guò)RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

三、構(gòu)建重組表達(dá)載體
1.  載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶（同引物的酶切位點(diǎn)）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
2.  PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

四、獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
1.  將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
2.  測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
3.  以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

五、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的誘導(dǎo)
1.   接種含有重組氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白的大腸桿菌BL21菌株于5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含100 ug/mL 氨芐青霉素），37℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
2.  按1∶50或1：100的比例稀釋過(guò)夜菌，一般轉(zhuǎn)接1 mL過(guò)夜培養(yǎng)物于100 mL（含100 ug/mL 氨芐青霉素）LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.6 - 0.8（最好0.6，大約需3 h）。取10 ul 樣品用于SDS-PAGE 分析。
3.   對(duì)照組不加誘導(dǎo)劑，實(shí)驗(yàn)組加入IPTG至終濃度0.5 mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1-3h。
4.  12 000 rpm 離心10 min，棄上清，菌體沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。

六、氯霉素酰基轉(zhuǎn)移酶重組蛋白的分離、純化
1.  NTA層析柱的準(zhǔn)備：在層析柱中加入1 mL NTA介質(zhì)，并分別用8 mL 去離子水，8 mL上樣緩沖液洗滌。
2.  重組蛋白的變性裂解：在冰浴中凍融菌體沉淀，加入5 mL上樣緩沖液， 用吸管抽吸重懸，超聲波破裂菌體，用振蕩器等輕柔的混勻樣品60 min，4℃ 12000 rpm 離心 30 min，將上清吸至一個(gè)干凈的容器中，并棄沉淀。取10 ul 上清樣品用于SDS-PAGE 分析。
3.  上清樣品以10-15 mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
4.  洗脫雜蛋白：用Washing Buffer以10-15 mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01分步收集洗脫液，約3-4 h，取10 ul洗脫開(kāi)始時(shí)的樣品用于SDS-PAGE 分析。
5.  洗脫目標(biāo)蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 級(jí)分，分別取10 ul樣品用于SDS-PAGE 分析。
      
注意事項(xiàng)
1.  選擇表達(dá)載體時(shí)，要根據(jù)所表達(dá)蛋白的最終應(yīng)用考慮。如為方便純化，可選擇融合表達(dá)；如為獲得天然蛋白，可選擇非融合表達(dá)。
2.  融合表達(dá)時(shí)在選擇外源DNA同載體分子連接反應(yīng)時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過(guò)程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不能發(fā)生干擾。
3.  菌液OD值要小于1，否則細(xì)胞太濃太老，不易破碎，且質(zhì)粒易丟失。
4.  誘導(dǎo)時(shí)間最好做一個(gè)梯度，不同蛋白誘導(dǎo)時(shí)間需摸索。
5.  誘導(dǎo)溫度適當(dāng)摸索：25、30℃。
6.  IPTG濃度：一般在1 mM 以?xún)?nèi)，可適當(dāng)摸索。
7.  超聲條件可視實(shí)際情況改變，只要使菌體裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠。

其他
一、原核表達(dá)
1.  原核表達(dá)簡(jiǎn)介
將克隆化基因插入合適載體后導(dǎo)入大腸桿菌用于表達(dá)大量蛋白質(zhì)的方法一般稱(chēng)為原核表達(dá)。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應(yīng)用。

2.  大腸桿菌用于表達(dá)重組蛋白的特點(diǎn)
（1）易于生長(zhǎng)和控制；
（2）用于細(xì)菌培養(yǎng)的材料不及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)的材料昂貴；
（3）有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質(zhì)粒可供選擇；
（4）在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白由于缺少修飾和糖基化、磷酸化等翻譯后加工，常形成包涵體而影響表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性及構(gòu)象。

3.  原核表達(dá)載體
通常為質(zhì)粒，典型的表達(dá)載體應(yīng)具有以下幾種元件：
（1）選擇標(biāo)志的編碼序列；
（2）可控轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子；
（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(轉(zhuǎn)錄終止子，核糖體結(jié)合位點(diǎn))；
（4）一個(gè)多限制酶切位點(diǎn)接頭；
（5）宿主體內(nèi)自主復(fù)制的序列。

4.  原核表達(dá)一般程序
獲得目的基因－準(zhǔn)備表達(dá)載體－將目的基因插入表達(dá)載體中（測(cè)序驗(yàn)證）－轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌－誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)－表達(dá)蛋白的分析－擴(kuò)增、純化、進(jìn)一步檢測(cè)。