人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC) 的培養(yǎng)方法

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 (HUVEC) 是從臍帶靜脈中分離出來的原代細(xì)胞。這種細(xì)胞是研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞的模型系統(tǒng)，研究相關(guān)的低氧、炎癥、氧化應(yīng)激、感染反應(yīng)以及正常和腫瘤相關(guān)血管生成等應(yīng)用。TNF-α 和 IFN-γ 等細(xì)胞因子會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活（一種炎性反應(yīng)），并導(dǎo)致 VCAM-1/CD106 等細(xì)胞黏附分子上調(diào)，這些上調(diào)可使用熒光標(biāo)記抗體和細(xì)胞成像進(jìn)行定量，以下是人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）培養(yǎng)操作方法。

一、實(shí)驗(yàn)方法原理

本實(shí)驗(yàn)采用新鮮的健康產(chǎn)婦新生兒臍帶，采用膠原酶Ⅰ型用消化分離得到臍靜脈內(nèi)皮原代細(xì)胞。膠原酶是理想的血管內(nèi)皮細(xì)胞分離酶，對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用，能使上皮細(xì)胞與膠原組織成功分離，且不損傷內(nèi)皮細(xì)胞，分離出的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量多，雜細(xì)胞污染少，且細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。

二、實(shí)驗(yàn)材料    

1. 分離好的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC

2. 試劑、試劑盒    

PBS膠原酶M199培養(yǎng)基胰酶EDTADMEM培養(yǎng)基

3. 儀器、耗材    

針頭手術(shù)鉗離心管低溫離心機(jī)彎管明膠恒溫培養(yǎng)箱顯微鏡

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 將 15-20cm 長的新生兒臍帶放入無菌的 PBS 溶液中儲(chǔ)存。（注：4℃下最多貯存 24 小時(shí)，室溫下不超過 6 小時(shí)，否則廢棄）

2. 用一個(gè)鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗 3-5 次，將污血沖洗干凈為止。

3. 用手術(shù)鉗夾緊臍帶下端，加入 15ml 的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化 15-20分鐘，并不時(shí)上下?lián)u動(dòng)臍帶。

4. 消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個(gè) 50 ml 無菌離心管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗臍帶 2-3 次。

5. 將收集液離心（2000 轉(zhuǎn)/ 分）3 分鐘。

6. 倒去上清，加入 10ml M199 培養(yǎng)基（加入 10U/ml 的 bFGF） ，用彎管吹散細(xì) 胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個(gè)用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)。（注：每個(gè)培養(yǎng)瓶中加入 3- 4ml 無菌的 1%的明膠溶液，搖勻使得明膠溶液* 鋪滿瓶底，放入 37℃孵育，最少 2 小時(shí)，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被 有利于細(xì)胞貼壁。 ）

7. 培養(yǎng) 24 小時(shí)后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入 10 ml 新鮮的 M199 培養(yǎng)基。

8. 以后每 2 天換一次培養(yǎng)基（每次換掉 2/3 的培養(yǎng)基） 。

9. 一般培養(yǎng) 5-7 天，細(xì)胞可長滿至 80-90%單層，這時(shí)可以傳代。

10. 倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS 溶液清洗 2-3 次，加入2- 3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

11. 用彎管將細(xì)胞吹打下來，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè) 50 ml 無菌離心管中，2000 轉(zhuǎn)/ 分，離心 3 分鐘。

12. 倒掉上清，加入 10ml新鮮培基，一般一瓶細(xì)胞可傳代 3-4 瓶，以后照此傳代培養(yǎng)。

13. 一般傳代 2-3 代（培養(yǎng)了 20 天左右）用于做各種實(shí)驗(yàn)效果較為好。

四、注意事項(xiàng)    

1. 嚴(yán)格進(jìn)行消毒．使用三套器械取材。

2. 嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止細(xì)菌、真菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。

3. 吸取液體前，瓶口和吸管進(jìn)行火焰消毒；經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷卻。防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。吸取液體時(shí)，避免瓶口和吸管接觸碰撞。

4. 離心管入臺(tái)前，管口、管壁應(yīng)消毒。