大/小鼠骨髓間充質干細胞的分離方法（一）

二十世紀七十年代，Friedenstein從骨髓中分離出一種多能基質細胞，呈梭形，可以進行體外克隆和多向分化，被稱為CFU－Fs(colony－formingunitfibro-blasts)。隨后，這種骨髓來源的基質細胞被進一步發現是間葉組織細胞譜系的共同前體細胞，因其具有干細胞的部分特性，而被命名為骨髓間充質干細胞(BMSCs)。

BMSCs來源方便，易于分離、培養、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，免疫原性低。但是不同的分離培養方法使得BMSCs在體外擴增時的純度、活性、表型和分化潛能差異很大，導致基礎研究結論各異和臨床試驗效果不一。因此，深入認識BMSCs不同分離方法和培養條件的優缺點，并根據實驗目的做出相應選擇，是進行BMSCs實驗研究的關鍵環節。

01  貼壁篩選法

貼壁篩選法是利用細胞貼壁時間及貼壁牢固性的不同，逐步將非貼壁細胞和其它雜質細胞去除的一種簡單易行的方法，常用于干細胞的培養中，因此用于分離BMSCs最為廣泛。

利用BMSCs貼壁生長特性，更換培養液逐步去除漂浮生長的造血系統細胞即可獲得較純化的BMSCs；而且骨髓中的造血干細胞能分泌生長因子和促貼壁物質,可促進BMSCs貼壁生長，貼壁篩選法也常被稱為直接培養法或者全骨髓法。

操作步驟

01  以頸椎脫臼法處死SPF級3-4周齡C57BL/6J小鼠或者SD/Wistar大鼠，用75%乙醇浸泡。

02  隨后在鼠的腿的位置剪開外皮和內皮，無菌狀態下取出雙側股骨和脛骨，浸泡于無菌含雙抗PBS溶液中。剔除股骨和脛骨周圍的肌肉、結締組織（圖1-1），用含雙抗的PBS溶液清洗三遍。

03  用眼科剪剪去股骨和脛骨的兩端，暴露骨髓腔（圖1-2）。

04  用注射器以*培養基反復沖洗骨髓腔直至骨頭發白（圖1-3）。

05  收集骨髓液（圖1-4），離心（圖1-5），后加入適當培養基（含20%血清）（圖1-6）接種于培養基皿（圖1-7）中置于37℃，5％ CO2，飽和濕度的細胞培養箱中培養（圖1-8）。

06  24-48h后去懸浮，接下來的每3天換液一次，直到需要傳代。

圖1 貼壁篩選法分離提取BMSCs

對初次培養者來說，貼壁法分離BMSCs操作簡單易掌握，不易發生污染，是一個較好的分離方法。不足的是分離提取的細胞純度相對不高。

02  骨組織消化法

骨組織消化法操作簡單、成本低，且獲得的BMSCs純度較貼壁篩選法高，是分離BMSCs較為常用的方法。

操作步驟

01  參照貼壁篩選法上述操作步驟第1-3步，收集沖去骨髓的股/脛骨于無菌的培養皿中，用無菌眼科剪小心地將骨組織剪成約1～3mm3的碎片。

02  之后加入適量含1mg/mL Ⅱ型膠原酶的新鮮*培養基（含5% FBS），于37℃搖床中振蕩消化 。

03  消化結束后離心，棄上清液，用PBS清洗兩次，然后將骨碎片接種于培養皿中，加入適量新鮮的*培養基（含20% FBS）淹沒骨碎片，并置于37℃ 5%二氧化碳培養箱中培養。

04  培養至72h后進行半量換液。此后每3天換一次液。待貼壁細胞達到80%~90%融合，進行細胞擴增傳代。

使用骨組織消化法分離BMSCs也并非*有效，II型膠原酶的消化可能影響BMSCs活性及增殖能力。