1、ELISA試驗(yàn)的穩(wěn)定性問(wèn)題?

　　做ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)，結(jié)果老是重復(fù)性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的結(jié)果就截然不同，上午做時(shí)其OD在1.5，下午做時(shí)就是0.9了，所以都沒(méi)有辦法下結(jié)論，為什么會(huì)差異這么大呀？?

　　（1）多設(shè)平行空孔，?請(qǐng)別人代勞，以判斷究竟是否操作問(wèn)題?

　　（2）對(duì)于活性非常高的包被物和酶標(biāo)記物，如果第一次選擇的范圍恰好在其平臺(tái)位置邊

　　緣，那么在重復(fù)的時(shí)候，每次取樣帶來(lái)的微量誤差就很容易導(dǎo)致大的偏差了，特別是線性比較好的原料試劑，這個(gè)就很正常了。建議每次取樣的時(shí)候只使槍尖一點(diǎn)點(diǎn)位于液面下，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗體or酶而使結(jié)果重復(fù)不上。?

　　2、酶不穩(wěn)定，有何高招？?

　　（1）保存濃度盡量高些，?

　　（2）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保護(hù)劑，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解。?

　　（3）加入50%甘油-20度保存、避免反復(fù)凍融。?

　　（4）還可以加入防腐劑防止長(zhǎng)菌（注意不能用疊氮鈉，其對(duì)HRP活性有很大影響）?（5）現(xiàn)在一些公司也有商品化的酶標(biāo)保護(hù)劑供應(yīng)，可以考慮一下?酶類的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無(wú)明顯變化，貯藏要求簡(jiǎn)單，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可。液態(tài)穩(wěn)定性較差，貯藏時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：?1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易降解、變性。?2、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對(duì)某些酶也有一定保護(hù)作用。?3、貯藏溫度要求低，避免反復(fù)凍融。??

　　3、ELISA試驗(yàn)中不加標(biāo)本的OD值反而高于加人的陰性標(biāo)本的OD值，是什么原因呀？?

　　做夾心法ELISA試驗(yàn)中不加標(biāo)本的OD值反而高于加人的陰性標(biāo)本的OD值，是什么原因呀？?

　　最大的原因是封閉的效果不好，應(yīng)該調(diào)整封閉液；?

　　可以嘗試不同的封閉劑（BSA、膠脂奶粉、明膠等）、不同的封閉濃度、時(shí)間，試試哪個(gè)效果好?

　　陰性的里面的其他蛋白起到了封閉的效果??

　　4、邊緣的陰性O(shè)D值老是比中間的偏高，什么原因呢？?

　　我做ELISA時(shí)，有一段時(shí)間在板的最后一條板孔的陰性的OD值經(jīng)常比在中間的高，有時(shí)候高出0.1個(gè)OD，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)經(jīng)常重復(fù)，但原因也找不到在哪里？?

　　這可能是由于ELISA的邊緣效應(yīng)造成的。?ELISA的邊緣效應(yīng)是指邊緣孔與中心孔反應(yīng)條件不一致，由于邊緣效應(yīng)的影響，同一標(biāo)本在邊緣孔測(cè)定的結(jié)果明顯高于中央孔，且隨邊緣孔與中央孔的距離的增加而增強(qiáng)。原因在于試驗(yàn)過(guò)程中邊緣孔與中央孔的溫度、液體蒸發(fā)程度不同以及各孔表面存在光潔度等物理性狀的差異有關(guān)。為克服其影響，應(yīng)盡可能使用中央孔及其周圍反應(yīng)孔。ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。?另外，酶標(biāo)板也是一個(gè)比較重要的因素，選擇質(zhì)量好一點(diǎn)的板能一定程度減少板內(nèi)誤差，我用costar的板，到目前為止還沒(méi)有出現(xiàn)邊緣孔與中心孔反應(yīng)不均的情況。??

　　5、做ELISA對(duì)梯度怎么要求的啊？?

　　做ELISA的時(shí)候老板讓我們選擇的抗原or抗體都是有明顯梯度的，不是很明白他們的觀點(diǎn)，有時(shí)候稀釋不同的倍數(shù)但是活性相差不大，就象在一個(gè)平臺(tái)區(qū)段自己感覺(jué)在這么一個(gè)范圍里面都可以使用應(yīng)該更好，這樣即使是有很小的取樣誤差也不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)，應(yīng)該更好才對(duì)！做ELISA對(duì)梯度這么要求究竟是什么目的，具體怎么要求的啊？?

　　（1）?我們做ELISA試驗(yàn)時(shí)是要求梯度比較明顯的才是好的抗原，每個(gè)抗原都會(huì)有一

　　個(gè)最適平臺(tái)期，就是在這個(gè)范圍之內(nèi)變化浮動(dòng)不會(huì)很明顯，所以我們會(huì)選擇平臺(tái)期的起點(diǎn)不會(huì)選擇終點(diǎn)。如果你沒(méi)有做到他的下限的話就不會(huì)知道抗原在哪個(gè)濃度時(shí)是平臺(tái)期的終點(diǎn)，有可能你選擇的是終點(diǎn)，這樣就不是最佳的抗原濃度。等到做穩(wěn)定性試驗(yàn)時(shí)靈敏度應(yīng)該會(huì)下降的很明顯。?

　　既然選擇的是平臺(tái)期的起點(diǎn)，那么也就是再往后是一個(gè)平臺(tái)期了，那也不會(huì)有什么梯度了，這樣看得話有明顯梯度的，如果處于下降階段的反倒沒(méi)什么用了，這樣更難找平臺(tái)期的起點(diǎn)？?

　　（2）?看你走的包被濃度的范圍怎么樣，如果跨度很大的話，梯度就會(huì)很明顯。反之，

　　跨度小的話就不會(huì)有很明顯的梯度，說(shuō)明你應(yīng)該在這一段之間選擇最適濃度?

　　6、做elisa試劑盒一定要帶上陰陽(yáng)性對(duì)照嗎？對(duì)試劑盒起到什么作用？?

　　對(duì)照最最基本的作用是評(píng)價(jià)你的實(shí)驗(yàn)體系：陰性對(duì)照驗(yàn)證你的實(shí)驗(yàn)是否存在污染造成假陽(yáng)性；陽(yáng)性標(biāo)本驗(yàn)證你的實(shí)驗(yàn)體系是否成立。?可以不做，但出了問(wèn)題你會(huì)抓不找頭緒，不知道問(wèn)題出在什么地方。此外，如果作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)必須要有對(duì)照。?

　　陽(yáng)性對(duì)照品(positive?control)和陰性對(duì)照品(negative?control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照，因此對(duì)照品，特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，對(duì)照品最好也為人血清，因?yàn)檎Ｈ搜逶诟鞣NELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。?陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。?陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，陽(yáng)性判定值（cut-off?value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。?質(zhì)控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質(zhì)控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點(diǎn)上，定性測(cè)定時(shí)處于弱陽(yáng)性水平，稱為臨界值。乙肝標(biāo)志物臨界值的制定，應(yīng)按臨床要求，為臨床提供統(tǒng)一的判斷弱陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。?臨界值質(zhì)控血清可以作為試劑盒中的陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品以外的第三個(gè)對(duì)照品，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽(yáng)性反應(yīng)的標(biāo)本不漏檢。??

　　7、把酶加到顯色劑中A和B中，為什么在A中酶活性掉得比較慢，但是在B中就掉得很快，是什么原因呢？?

　　HRP的顯色試劑，不管是直接顯色的還是曝光的，A液都是顯色底物，但不是直接與HRP作用的，而是呈色/曝光的底物（DAB，TMB,?Luminol等），它們的直接激活物是O2－；B液一般是過(guò)氧化氫，這才是HRP的直接底物。?整個(gè)HRP顯色的過(guò)程是：過(guò)氧化氫被HRP催化放出O2－，然后作用于呈色/曝光底物，產(chǎn)生顏色/發(fā)光現(xiàn)象。由于過(guò)氧化氫性質(zhì)不穩(wěn)定，所以不能將它與顯色/發(fā)光底物長(zhǎng)時(shí)間保存一起，所以一般的Kit都是裝成A、B兩管。?

　　8、夾心ELISA中本底高，該如何控制？?

　　本人在夾心ELISA實(shí)驗(yàn)中，先用一種單抗包被ELISA板，使用的酶標(biāo)抗體是biotin標(biāo)記的另一單抗，但問(wèn)題是本底高，該如何控制？?

　　可能出現(xiàn)的原因有：?

　　1。單抗與后續(xù)的生物素標(biāo)記的抗體發(fā)生了非特異性吸附，所以加入HRP標(biāo)記的鏈親和素時(shí)，導(dǎo)致OD值相應(yīng)增加；?

　　2。加入HRP標(biāo)記的鏈親和素的濃度過(guò)高，洗滌不*；?3。封閉不*?

　　4。生物素標(biāo)記的抗體與封閉劑發(fā)生非特異性吸附??

　　9、檢測(cè)腦鈉肽時(shí)為什么要加入EDTA和抑肽酶啊?

　　加入EDTA的目的是抗凝,獲取血漿進(jìn)行分析.?

　　要加入適量的抑肽酶，用以抑制血漿內(nèi)源性水解酶對(duì)待測(cè)物的降解。