HAKATA培養(yǎng)基大量現(xiàn)貨*：

細(xì)胞污染，如何挽救？

以自建細(xì)胞系(laryngeal squamous carcinoma-1，LSC-1)第12代的某一被細(xì)菌污染的細(xì)胞株采取救治，比較效果并分析細(xì)胞生物學(xué)特性。

實驗方法

1)抗生素法：

細(xì)菌培養(yǎng)：用無抗生素*培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞3 d，收集上清離心后將沉淀物接種于血瓊脂培養(yǎng)基，35e培養(yǎng)。

所采用的抗生素包括臨床常用的15種抗生素，抗生素zui適抑菌濃度篩選:根據(jù)細(xì)菌藥敏實驗結(jié)果選出敏感抗生素，每種抗生素從zui低抑菌濃度MIC到zui高耐藥濃度分別配制6個濃度梯度。將LSC-1細(xì)胞按1*104/孔種96孔板，細(xì)胞貼壁后加入含敏感抗生素的*培養(yǎng)液，24 h后換無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d，如此重復(fù)3次，連續(xù)7 d。

2)抗生素聯(lián)合巨噬細(xì)胞吞噬法:

將上述抗生素處理過的細(xì)胞再用小鼠的巨噬細(xì)胞處理。巨噬細(xì)胞的制備:將滅菌的玻璃粉與0. 9%氯化鈉注射液混和注入小鼠腹腔， 3 d后脫頸處死動物，無菌操作取小鼠腹腔液，離心收集巨噬細(xì)胞，與LSC-1細(xì)胞混合培養(yǎng)， 3 d后換液，棄去巨噬細(xì)胞。間隔一周后再用巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)一次。

3)裸鼠體內(nèi)接種法:

將LSC-1細(xì)胞按1*106個/mL接種裸鼠腋下皮下，連續(xù)觀察，當(dāng)腫物長至約1cm3后，脫頸處死動物，無菌操作取出腫物，采取組織塊法做組織細(xì)胞培養(yǎng)。

效果鑒定

免疫組織化學(xué)鑒定:

將上述3種方法處理的LSC-1細(xì)胞種植在直徑為15 mm的無菌圓形蓋玻片上，貼壁后做角蛋白AE1 /AE3免疫組化染色、HE染色

細(xì)胞周期鑒定:

采用流式細(xì)胞儀測量碘化丙啶標(biāo)記細(xì)胞的熒光強度，分析DNA含量。測試3種方法處理的LSC-1細(xì)胞周期，并與該細(xì)胞建系初期的第3代細(xì)胞狀況做比對。

抗生素撤離觀察:

用無抗生素的*培養(yǎng)基培養(yǎng)3種方法處理的細(xì)胞，連續(xù)觀察3周，取細(xì)胞上清做細(xì)菌培養(yǎng)。

細(xì)胞系的維持、凍存與復(fù)蘇:

將無抗生素培養(yǎng)3周的細(xì)胞按常規(guī)方法凍存，并于1個月后復(fù)蘇，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

結(jié)果

自建人喉癌細(xì)胞系LSC-1傳至第12代以后，細(xì)胞生長速度變慢，已貼壁細(xì)胞變圓、漂起、死亡，細(xì)胞間隙出現(xiàn)可運動的微小生物，但培養(yǎng)液依然清亮不渾濁，收取上清液離心，將沉淀物行常規(guī)血瓊脂培養(yǎng)， 24 h結(jié)果為無菌生長，培養(yǎng)5~7 d后開始出現(xiàn)灰白色細(xì)小菌落，光滑濕潤，有透明溶血環(huán)，全自動細(xì)菌鑒定儀生化鑒定條檢測為嗜麥芽寡養(yǎng)食單胞菌，該菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌。細(xì)菌藥敏結(jié)果:在15種抗生素中，該菌僅對頭孢他啶、哌啦西林、頭孢哌酮/舒巴坦3種藥物敏感，其余均耐藥。

2.1 抗生素法除菌效果

經(jīng)篩選， LSC-1細(xì)胞可耐受的抗生素zui佳抑菌濃度分別為:哌啦西林64 mg /L、頭孢他啶2 mg /L、頭孢哌酮/舒巴坦32 mg /L。LSC-1細(xì)胞在哌啦西林和頭孢他啶zui佳抑菌濃度中分別傳代一次，在頭孢哌酮/舒巴坦中傳代3次，并每種細(xì)胞各凍存3株。復(fù)蘇情況:哌啦西林3株均未貼壁，頭孢他啶兩株復(fù)蘇后貼壁，但生長一周后均出現(xiàn)細(xì)菌，細(xì)胞死亡;另一株第二次凍存，再次復(fù)蘇后生長良好，但抗生素撤離后出現(xiàn)細(xì)菌，經(jīng)鑒定仍為嗜麥芽寡養(yǎng)食單胞菌。頭孢哌酮/舒巴坦3株復(fù)蘇后均能存活，但生長緩慢，一周傳代一次，仍有少量細(xì)菌，抗生素撤離后重又出現(xiàn)細(xì)菌污染。在3種抗生素中，頭孢哌酮/舒巴坦抗菌作用和細(xì)胞生長狀態(tài)zui好，頭孢他啶對細(xì)胞損傷較大，細(xì)胞表面粗糙，狀態(tài)較差。

2.2 抗生素聯(lián)合巨噬細(xì)胞吞噬法除菌效果

比較頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細(xì)胞先后使用和二者交替使用的除菌效果，并觀察細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的傳代次數(shù)，具體方法為:頭孢哌酮/舒巴坦32 mg /L培養(yǎng)1次、2次、4次后，再分別與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)2次，各凍存1株;頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細(xì)胞交替培養(yǎng)3次，凍存1株。復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài):頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細(xì)胞依次使用者中，抗生素使用次數(shù)較多的細(xì)胞傳代次數(shù)較多(5代);二者交替使用的細(xì)胞狀態(tài)更好于前3株細(xì)胞，且傳代次數(shù)也zui多(6代)。然而所有細(xì)胞zui終因狀態(tài)不佳或污染重現(xiàn)而死亡。

裸鼠體內(nèi)接種法除菌效果

腫瘤細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)40 d后開始出現(xiàn)腫塊， 60d長至1 cm3左右。處死動物取出腫物，瘤體質(zhì)量0. 39 g，體積為0. 8 cm*0. 6 cm*0. 4 cm。將組織塊培養(yǎng)于含三抗的*培養(yǎng)基， 14 d后改用無抗生素培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)3周，細(xì)胞生長良好。之后自然傳代8次，凍存1個月后復(fù)蘇，細(xì)胞仍能貼壁生長。取上清液做細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果為無菌生長。

2.4 細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性

抗生素處理及裸鼠接種后的LSC-1細(xì)胞形態(tài)與LSC-1第三代基本相同，細(xì)胞呈多邊形，有鋪路石感。

免疫組織化學(xué)細(xì)胞角蛋白染色，裸鼠接種后的和抗生素處理的細(xì)胞均有AE1 /AE3陽性表達，但前者陽性比例(圖1H)與第三代細(xì)胞(圖1G)接近，后者陽性表達較少。

HE染色，接種裸鼠的LSC-1細(xì)胞具有高度的異型性:細(xì)胞形態(tài)及大小不等;核呈多形性:大小、形態(tài)及染色各異，胞核與胞質(zhì)比例增大(接近1B1)，核仁粗大，數(shù)目增多，核分裂象增多，出現(xiàn)不對稱、多極性等病理性核分裂，偶見巨核細(xì)胞，胞質(zhì)有糖原顆粒，與LSC-1第三代細(xì)胞形態(tài)相一致。

2.5 細(xì)胞倍體狀況及細(xì)胞增殖周期分析結(jié)果

用頭孢哌酮/舒巴坦處理3次后， LSC-1細(xì)胞周期直方圖雖為近二倍體圖像，但S期、G2M期細(xì)胞峰較高，仍具有癌細(xì)胞的特點。裸鼠接種的LSC-1細(xì)胞呈現(xiàn)非整倍體圖像，且二倍體和異倍體的S期、G2M期峰均較高，更接近第3代LSC-1細(xì)胞周期DNA含量分布。3種細(xì)胞各核型比例:裸鼠接種細(xì)胞仍保持二倍體和異倍體核型，分別占44. 92%和55. 08%，與第3代細(xì)胞(二倍體41. 52%、異倍體58. 48% )基本相同，而頭孢哌酮/舒巴坦處理的細(xì)胞全部為二倍體，異倍體細(xì)胞消失。

討論

挽救污染細(xì)胞的方法有抗生素除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法和動物接種除菌法，其中較常使用的是抗生素沖擊法。清除效果的檢驗應(yīng)包括無菌檢驗和細(xì)胞性狀評估。無菌檢驗指細(xì)胞在無抗生素培養(yǎng)基中傳代3~4次，顯微鏡下觀察無細(xì)菌、培養(yǎng)上清細(xì)菌無菌生長，方可確定污染細(xì)菌被消除干凈。細(xì)胞的組織來源鑒定和染色體分析是細(xì)胞系鑒定的兩個主要方面。LSC-1為喉鱗狀上皮來源細(xì)胞系，參照相關(guān)文獻，我們選用角蛋白免疫組織化學(xué)鑒定和細(xì)胞周期DNA倍體分析方法評估細(xì)胞性狀。

細(xì)胞系中麥芽窄食單胞菌有可能來源于標(biāo)本本身。由于該菌對氨基糖甙類和很多B-內(nèi)酰胺類(包括碳青霉烯類)天然耐藥，故常規(guī)培養(yǎng)液中的青、鏈霉素不能*抑制其生長。有研究顯示，該菌僅對少數(shù)幾種抗生素如頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶等耐藥性較低，本文得到了相同的結(jié)果。本實驗采用15種抗生素對該菌的抑菌效果進行測定，找出其中有效的3種，又分別對這3種抗生素的6個梯度濃度測試，zui后確定抗菌效果zui好、細(xì)胞毒性zui小濃度為32 mg /L頭孢哌酮/舒巴坦，其作用能控制細(xì)菌生長并使細(xì)胞傳代2~3代，當(dāng)聯(lián)合使用小鼠巨噬細(xì)胞后又使細(xì)胞傳代次數(shù)增加到5~6代。然而，抗生素的作用主要是通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成達到抑制細(xì)菌生長的效果，并不能直接殺死細(xì)菌。有研究表明，單獨使用抗生素處理細(xì)菌污染的KB口腔上皮樣癌細(xì)胞系，不能*清除細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。巨噬細(xì)胞在體外沒有其他免疫細(xì)胞和抗體等因素的參與下，其吞噬功能是有限的，在這里僅起到輔助抗生素的作用， (相關(guān)的報道有用于挽救支原體污染的細(xì)胞，但體外抗細(xì)菌的作用尚未見報道)，故當(dāng)抗生素撤離后以上2種方法處理的細(xì)胞中細(xì)菌再次出現(xiàn)。

另外，抗生素對培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和性狀都有一定的影響。本實驗有效的3種抗生素中，頭孢他啶毒性zui大，頭孢哌酮/舒巴坦雖然毒性相對弱一些，但也使喉癌細(xì)胞角蛋白AE1 /AE3表達有所減少、DNA倍體分析原有的異倍體細(xì)胞消失，接種裸鼠后不能成瘤。因此可以認(rèn)為，有針對性地使用抗生素或許可以短期控制住細(xì)胞系中污染細(xì)菌生長，但同時可能伴隨有細(xì)胞生物學(xué)特性變化。進而推論，抗生素沖擊法也難控制細(xì)菌再次暴發(fā)性生長，而且對細(xì)胞更有損傷。至于那些不做污染菌的分離和鑒定、僅靠單一某種廣譜抗生素來對付所有污染細(xì)菌，或是僅參照臨床用藥劑量來設(shè)計抗生素濃度等做法更不可取。

動物體內(nèi)接種除菌法是利用動物的免疫系統(tǒng)來消滅污染微生物的方法。常用的動物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠，其T細(xì)胞缺如致使特異性細(xì)胞免疫功能喪失，但B細(xì)胞功能依然正常以及非特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)NK細(xì)胞活力強，故可用于腫瘤細(xì)胞的污染清除。細(xì)菌在裸鼠體內(nèi)可被巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞吞噬、NK細(xì)胞殺滅、IgM、IgG類抗體結(jié)合病菌后激活補體殺死或溶解等。本實驗結(jié)果顯示，接種BALB /c-nu裸鼠之后的LSC-1細(xì)胞形態(tài)良好、生長旺盛，細(xì)胞間沒有細(xì)小微生物，傳代多達8次后，細(xì)胞凍存和復(fù)蘇仍能正常生長，并在抗生素撤離后細(xì)胞生長狀態(tài)不變，細(xì)菌培養(yǎng)為陰性。

細(xì)胞生物學(xué)特性上，細(xì)胞角蛋白陽性表達比例較高，與第3代LSC-1接近，保持了原有上皮來源的性質(zhì)，組織病理學(xué)觀察仍具有高度的異型性及腫瘤細(xì)胞的特征，細(xì)胞倍體及增殖周期分析結(jié)果顯示異倍體細(xì)胞及S期細(xì)胞的比例與第3代細(xì)胞相同。實驗表明，利用裸鼠去除腫瘤細(xì)胞系中的污染細(xì)菌是zui為理想的方法，既能*清除污染細(xì)菌，又能保持腫瘤細(xì)胞的來源特征和惡性特性。