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        細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代方法 蒂科生物

        2017-01-16 瀏覽次數(shù):2613

        有經(jīng)驗(yàn)和剛剛從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的人員都應(yīng)該認(rèn)真仔細(xì)地詢問下細(xì)胞提供方提供的建議,提前了解所要培養(yǎng)細(xì)胞的詳細(xì)資料,準(zhǔn)備好細(xì)胞所要用到的培養(yǎng)基和相關(guān)試劑,雖然所有的貼壁,半貼壁或者懸浮細(xì)胞處理方式差不多,但是不同的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件和處理力度還有試劑的批間差這些問題存在,也會(huì)導(dǎo)致對(duì)細(xì)胞處理不當(dāng),或者環(huán)境的不適應(yīng)而造成細(xì)胞的死亡。

        1.收到細(xì)胞,*時(shí)間要鏡檢:觀察細(xì)胞形態(tài)是否正常,對(duì)于貼壁細(xì)胞則要注意看貼壁情況是否很好,觀察細(xì)胞密度,有疑議及時(shí)咨提供細(xì)胞的技術(shù)人員。 由于運(yùn)輸?shù)臅r(shí)間或者溫度的變化,很多貼壁細(xì)胞在盛滿培養(yǎng)基的瓶子里生長的狀態(tài)和平時(shí)會(huì)有點(diǎn)不一樣,主要是貼壁牢固問題。比如293T,平時(shí)貼壁就不是很牢,在裝滿的培養(yǎng)基瓶子里面,會(huì)發(fā)生大片的脫落,細(xì)胞聚集在一起,但是細(xì)胞生長還是正常的,通過離心收集,加以胰酶的消化,重新打散,又可以正常的貼壁生長。

        2.當(dāng)通過上一步的觀察,細(xì)胞初步?jīng)]有任何問題時(shí),進(jìn)行下一步操作。當(dāng)收到的細(xì)胞密達(dá)到80%左右時(shí),則處理如下:棄除瓶中大部分培養(yǎng)基,僅保留5到10mL培養(yǎng)所需的常規(guī)培養(yǎng)基;或更換新鮮的培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中,隨后每天觀察。 細(xì)胞在低于正常生長溫度情況下,會(huì)調(diào)整為靜止期,或者慢速生長期,必須恢復(fù)37度的環(huán)境至少3個(gè)小時(shí)左右,才能重新調(diào)整到接近對(duì)數(shù)生長期的狀態(tài),在對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行細(xì)胞的傳代會(huì)大大增加傳代的成功率,和細(xì)胞的存活率。

        3.如果經(jīng)*步觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞密度超過90%,并且細(xì)胞狀態(tài)很好時(shí),則復(fù)溫后2個(gè)小時(shí)需要立即傳代。傳代的比例應(yīng)依據(jù)不同的細(xì)胞而定。對(duì)于生長比較快,狀態(tài)穩(wěn)定,不易受外界影響的細(xì)胞可以一次多傳幾瓶;對(duì)于生長較慢,細(xì)胞比較薄,狀態(tài)容易波動(dòng)的細(xì)胞類型,一次少傳些,保證每瓶細(xì)胞密度大些,便于穩(wěn)定生長。至于一些比較陌生的細(xì)胞,*次處理也可以依照第二種情況。

        傳代操作:
        1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
        2.加入無菌pbs洗液(5-8mL)輕輕潤濕細(xì)胞,稀釋多余的培養(yǎng)基,之后吸走洗液,動(dòng)作要輕,不可吹打到細(xì)胞。
        3.向瓶內(nèi)加入含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少許,以能覆滿瓶底為限。
        4.置溫箱中2~5分鐘,一旦鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮,細(xì)胞間隙增大后,細(xì)胞變圓,比較松動(dòng)后,立即終止消化。
        5.加入該細(xì)胞對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基6mL(T25培養(yǎng)瓶)或12mL(T75培養(yǎng)瓶)終止消化。
        6.用吸管通過吸取的培養(yǎng)基輕輕反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞,使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。吹打時(shí)應(yīng)盡量以zui少的次數(shù)將細(xì)胞從壁上吹下,不僅要控制吹打的力度、次數(shù),還要注意要將細(xì)胞盡可能吹成單個(gè)。這樣既能減少死細(xì)胞,又能便于細(xì)胞再次均勻貼壁生長。
        7.依據(jù)傳代比例,將細(xì)胞懸液分瓶,再補(bǔ)充培養(yǎng)基后,靜置于溫箱培養(yǎng),直止貼壁。

        貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,繼續(xù)生長的空間不足,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份也消耗較多,同時(shí)代謝廢物也有較多堆積,需要分瓶培養(yǎng),對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如293,可以直接吹散后分瓶。而對(duì)于貼壁較緊的細(xì)胞如CHO,則需要以胰酶消化后再吹散分瓶。以筆者的經(jīng)驗(yàn),以輕吹或加培養(yǎng)液后輕搖可下較好,但對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不太充分的實(shí)驗(yàn)者而言是較難判斷掌握的。

        胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵:消化過度則對(duì)細(xì)胞的活性影響較大,并有部分細(xì)胞漂浮,隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下,反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。影響消化速度的因素較多,主要有胰酶溶液的活性(配制條件、凍存或4℃保存時(shí)間長短、是否反復(fù)凍融、解凍后存放時(shí)間及溫度等)、消化時(shí)的溫度(氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度)以及所加胰酶溶液的多少等。含有EDTA的胰酶會(huì)比不含的消化能力強(qiáng)很多,不同細(xì)胞對(duì)消化液的敏感性也不同,比如HEP-G2人肝癌細(xì)胞,該細(xì)胞消化時(shí)間可長達(dá)10分鐘左右。 消化時(shí)間仔細(xì)去摸索一下,每過2分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓,記錄*消化時(shí)間,下一次操作參考之前的記錄來控制時(shí)間即可。

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