傳代細(xì)胞培養(yǎng)

什么是傳代細(xì)胞培養(yǎng)？

原代細(xì)胞或細(xì)胞株或細(xì)胞系需在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的原代細(xì)胞或細(xì)胞株或細(xì)胞系或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)，這個(gè)過程體外培養(yǎng)稱為傳代細(xì)胞培養(yǎng)。一般認(rèn)為，細(xì)胞培養(yǎng)形成單層匯合，細(xì)胞密度與生存空間有密切的關(guān)系，將培養(yǎng)細(xì)胞分散，以1:2或l:3或1:4以上的比率轉(zhuǎn)移分散進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后，一般經(jīng)過三個(gè)階段：游離期、指數(shù)增生期和停止期。

常用細(xì)胞分裂指數(shù)表示細(xì)胞增殖的旺盛程度，即細(xì)胞群的分裂相數(shù)／100個(gè)細(xì)胞。一般細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.2％～0.5％，腫瘤細(xì)胞可達(dá)3～5％。細(xì)胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力時(shí)期，稱指數(shù)增生期(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，適宜進(jìn)行各種試驗(yàn)。

一、傳代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

（1）吸除或倒掉原瓶中的舊培養(yǎng)基（以25mL培養(yǎng)瓶為例）。

（2）每瓶加入2mL,無(wú)鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。

（3）每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，經(jīng)消化液鋪滿所有細(xì)胞表面，待細(xì)胞層略有松動(dòng)，肉眼可觀察到“薄膜”現(xiàn)象時(shí)，倒掉消化液，再繼續(xù)作用2~3分鐘，輕輕搖動(dòng)，細(xì)胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來(lái)，在顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞回縮變圓，細(xì)胞間隙增大，此時(shí)應(yīng)立即終止消化。

（4）加入*培養(yǎng)基5mL，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，吹打時(shí)要按順序進(jìn)行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，以避免細(xì)胞的機(jī)械損傷。

（5）用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的濃度，并用培養(yǎng)基調(diào)整適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。

二、傳代細(xì)胞的建系和維持

1、細(xì)胞檔案

細(xì)胞檔案要記錄好，如組織來(lái)源、生物學(xué)特性（由形態(tài)、生長(zhǎng)繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無(wú)支原體和潛存病毒等）、培養(yǎng)基的要求、傳代換液時(shí)間、擴(kuò)增時(shí)間（分裂指數(shù)），細(xì)胞的特殊遺傳標(biāo)志（標(biāo)記染色體）等，這些記錄對(duì)于保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，保持細(xì)胞的一致和經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)細(xì)胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。

2、換液傳代

（1）細(xì)胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規(guī)律性，因而在繼續(xù)傳代時(shí)，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性，這樣可以減少由于傳代時(shí)細(xì)胞密度的頻繁增減或換液時(shí)間的不規(guī)律而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)特性的改變，給以后的實(shí)驗(yàn)帶來(lái)影響。

（2）多種細(xì)胞系維持傳代，要嚴(yán)格操作程序，對(duì)所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后，細(xì)胞種子均應(yīng)凍存。傳代時(shí)均應(yīng)作好記錄，培養(yǎng)瓶上要有明顯標(biāo)記，標(biāo)記細(xì)胞系名稱和傳代的代數(shù)及傳代時(shí)間。細(xì)胞種子的及時(shí)凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細(xì)胞變異，此外還可提供不同代次的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。